Wir freuen uns, euch unser erstes Methodenpaper mit dem Titel „Revisiting Sodium Phosphotungstate and Ammonium Molybdate as Non-Radioactive Negative Staining Agents for Single Particle Analysis“ vorstellen zu können.

In unserer Studie konnten wir zeigen, dass wir Uranylformiat, unser standard Negativkontrastierungsreagenz, durch Natriumphosphorwolframat oder Ammoniummolybdat ersetzen können.

Unsere Tests mit Apoferritin haben gezeigt, dass diese nicht-radioaktiven Färbemittel in Kombination mit einem einfachen Fixierungsschritt auf dem Grid Kontrastierungsergebnisse zeigt, die mit denen von Uranylformiat vergleichbar sind.

Weitere Experimente mit β-Galaktosidase bestätigten, dass diese alternativen Färbemittel auch für die Analyse einzelner Partikel geeignet sind und Ergebnisse liefern, die sich praktisch nicht von denen mit Uranylformiat unterscheiden lassen. Da Natriumphosphowolframat und Ammoniummolybdat nicht radioaktiv sind, unterliegen diese nicht den strengen Handhabungsbeschränkungen, die mit uranylbasierten Färbemitteln verbunden sind, was nicht nur die Kosten senkt, sondern auch den Zugang zu dezentraler Probenvorbereitung unmittelbar nach der Reinigung erweitert, was einer größeren Anzahl von Wissenschaftlern in der Kryo-EM-Gemeinschaft zugute kommt.

Den vollständigen Artikel findet ihr auf BioRxiv mit einer ausführlichen Darstellung unserer Ergebnisse und einer schrittweise Beschreibung der Negativfärbung mit Phosphowolframat oder Ammoniummolybdat.

Ein Artikel unserer Praktikantin Malika Askarova über die Ergebnisse ihres Praktikumsmoduls

Mit der Entwicklung von Direktelektronendetektoren (DED) hat die Elektronenmikroskopie einen enormen Sprung in der erreichbaren Auflösung erfahren. Im Gegensatz zu ihrem konventionellen Gegenstück - den ladungsgekoppelten Bauelementen (CCD), die Elektronen in Photonen umwandeln und so ein Bild erzeugen - arbeiten DEDs, indem sie einfallende Elektronen direkt empfangen, was einen Teil des Rauschens eliminiert und den Signalverlust aufgrund der Elektronen-Photonen-Umwandlung verringert.

In der StruBiTEM-Facility setzen wir eine Falcon III-Kamera für die direkte Elektronendetektion (Thermo Fisher Scientific, MA, USA) ein, die zwei Arten der Datenerfassung ermöglicht: Integration und Counting. Im iIntegration Modus wird das von den einfallenden Elektronen stammende Signal integriert, summiert die  einfallenden Elektronen also auf. Aufgrund der Landau-Verteilung verursacht jedes Elektron, das unterschiedliche Energiemengen abgibt, zwangsläufig Landau-Rauschen, was zu einem geringeren Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) im Bild führt. Im Counting Modus wird das Landau-Rauschen vollständig eliminiert, da die einzelnen Elektronen, die auf den Detektor treffen, als eindeutige Ereignisse (1 oder 0) gezählt werden, so dass es keine Energievariabilität gibt.

Bei der Aufnahme von 1000 Mikrografen in jedem der Modi stellen wir einen leichten Vorteil des Counting gegenüber dem IIntegrationmodus hinsichtlich der Auflösung fest: 2,17 Å Auflösung im Counting gegenüber 2,31 Å Auflösung im Integrationmodus (Abbildung 1). Vergleicht man die in beiden Modi erzeugten 2D-Klassen, so erscheinen die im Countin erzeugten subjektiv besser, schärfer und mit weniger Hintergrundrauschen (Abbildung 1a und 1b).

Was den Durchsatz betrifft, so erzeugt der Integrationmodus mehr Bilder als der Countingmodus. Für die Gesamtdosis von 63,6 e-/Å2 im Integrationmodus betrug die Belichtungszeit nur 0,5 s. Die Gesamtdosis im Counting betrug 24,8 e-/Ų und die Aufnahmezeit 32,9 s. Tabelle 1 fasst die Daten für beide Modi zusammen.

In Anbetracht der unterschiedlichen Belichtungszeiten und der Tatsache, dass die Akquisitionszeit der am meisten begrenzende Faktor am Krios ist, wäre ein fairer Vergleich möglich, wenn man in jedem Modus 10 Stunden lang Daten aufnehmen und die resultierende Auflösung vergleichen würde. Während der Aufnahmezeit von 10 Stunden wurden 3370 Bilder im Integrationmodus aufgenommen, während 420 im Countingmodus aufgenommen wurden. Dabei wurden Auflösungen von 2,48 Å im Integrationmodus und 2,21 Å im Countingmodus erzielt.

Es stellt sich die Frage, ob man den Integrationmodus für eine schnellere Erfassung oder den Countingmodus für die Erfassung von Daten höherer Qualität verwenden sollte. Selbst wenn die Zeit der begrenzende Faktor ist, war der Countingmodus überlegen. Die in 10 Stunden aufgenommenen Daten ergaben eine höhere Auflösung im Countingmodus, obwohl 8 Mal weniger Daten produziert wurden. Bei kleinen Proteinen sind die höhere Auflösung und das bessere SNR im Countingmodus hilfreich, insbesondere für die Alinierung der Partikel, während bei größeren Partikeln mit hoher Symmetrie, die leicht zu alinieren sind, der Integrationmodus die beste Wahl sein könnte, da er die schnelle Erfassung einer großen Anzahl von Partikeln ermöglicht.

9. Februar 2022

Auch unsere zweite Testprobe, die tetramerische Beta-Galaktosidase mit einem Gesamtmolekulargewicht von 465 kDa, erreichte mühelos eine nahezu atomare Auflösung. Mit einer Auflösung von 2,2 Å sind wir nahe am aktuellen Rekord für dieses Protein, der bei 1,8 Å liegt. Für unseren Datensatz wurde der gesamte Prozess des Einfrierens, des Probenscreenings und der Datenerfassung der verwendeten 5000 Movies innerhalb eines einzigen Tages abgeschlossen.

Wir werden auch weiterhin Testproben wie Beta-Galaktosidase oder Apoferritin verwenden, um sicherzustellen, dass unsere Mikroskope immer unter Spitzenbedingungen arbeiten, um unseren Nutzern optimale Messungen zu garantieren.

8. Februar 2022

Ein Ziel unserer Einrichtung ist es, die Nutzung der Kryo-EM als wissenschaftliches Werkzeug für unsere Nutzer so einfach wie möglich zu machen. Ein Aspekt dabei ist, dass wir uns bemühen, die Datenverarbeitung zu zentralisieren, um zu verhindern, dass jede einzelne Arbeitsgruppe ihre eigene Workstation kaufen, installieren und warten muss. Mit dem RRZK haben wir dafür den idealen Partner - allerdings müssen wir die Daten von unseren Mikroskopen noch in den Compute-Cluster bekommen.

Ab heute haben wir eine direkte Glasfaserverbindung zu CHEOPS aufgebaut, die es unseren Nutzern ermöglicht, ihre Daten direkt in den Compute-Cluster zu übertragen und die zentralen Hardware- und Software-Ressourcen für ihre wissenschaftlichen Projekte zu nutzen. Erste Tests haben gezeigt, dass wir Übertragungsraten von 75 MB/s aufrechterhalten können, was es uns ermöglicht, Filme in voller Größe in weniger als 10 Sekunden zu übertragen. Diese hohe Übertragungsrate wird es uns ermöglichen, die bei CHEOPS verfügbaren Rechenressourcen zu nutzen, um eine Pipeline einzurichten, die es uns ermöglicht, 3D-Strukturen in Echtzeit zu rekonstruieren, während die Datenerfassung noch läuft. Derzeit befindet sich dies noch im Entwicklungsstadium, aber wir werden hoffentlich bald weitere Neuigkeiten dazu veröffentlichen können.

15. Oktober 2021

Wir können nun bestätigen, dass der Titan Krios außergewöhnlich gut funktioniert und seine erste Struktur mit nahezu atomarer Auflösung erzeugt hat. Mit Apoferritin als Testprobe konnten wir unter sehr einfachen experimentellen Bedingungen eine Auflösung von 1,95 Å erreichen: Standard-Kupfergrids und Integration anstelle von Counting Modus Insgesamt haben wir nur 2700 Movies in diesen Datensatz aufgenommen, so dass wir die Verarbeitung innerhalb von zwei Tagen nach Abschluss der Datenerfassung abschließen konnten.